Humane DNA beeinträchtigt die Sensitivität und Spezifität einer PCR

Die Leistungsfähigkeit und das Detektionslimit von PCR Assays für die Sepsis-Diagnose sind stark abhängig von der DNA-Aufreinigungsmethode. Eine Aufreinigung der Gesamt-DNA aus Blut generiert eine Mischung aus humaner DNA und pathogener DNA bei einer positiven Probe. Problematisch hierbei ist, dass die humane DNA Bindungsstellen für pathogen-spezifische Primer besitzt. Insbesondere bei einem hohen humanen DNA-Hintergrund kann diese Primer-Bindung an humane DNA zu falsch-negativen oder falsch-positiven Ergebnissen führen und beeinträchtigt somit die Sensitivität und Spezifität  des Assays (Navarro et al. 2002). So ein Verlust der Spezifität kann z.B. bei der in Abb. 1b gezeigten universellen 16S rDNA PCR beobachtet werden. Sie wird verursacht durch eine Co-Amplifikation von einem humanen DNA Abschnitt, welche Homologien zur pathogenen DNA aufweist. Durch das Entstehen zweier Amplifikate (Pathogen + Co.Amplifikat) ist eine Identifizierung mittels Sequenzierung nicht möglich. Weiter kann bei Abwesenheit eines Pathogens die Präsenz humaner DNA zu einem falsch-positiven Signal führen, wie in Abb. 1c gezeigt. Dieser Effekt wurde auch unter Verwendung eines anderen Primer-Paares beobachtet (Nadkarni et al. 2002).

Außerdem kann ein starker Überschuss an humaner DNA zu einem kompletten Versagen der PCR führen.

Abb. 1 Negativer Effekt humaner DNA auf eine universelle rDNA PCR zur Detektion von Bakterien

 a) 13 pg P. aeruginosa DNA (P.a), b) Mischung aus P. aeruginosa DNA (13 pg) und humaner DNA (hum.) (42ng), c) humane DNA (4 ng). Die Menge an humaner DNA entspricht der Menge, die durchschnittlich aus 0,2 ml Blut gewonnen wird. Die Menge an bakterieller DNA entspricht ca. 2000 Zellen.

Eine Mischung mit humaner DNA führt des Weiteren zu einem Verlust an Sensitivität. Im folgenden Beispiel (Abb. 2) verschob sich der Ct-Wert um ca. 3 Zyklen nach hinten im Vergleich zu rein pathogener DNA als Template (Abb. 2, linke Abb.).

Abb. 2 Verlust der Sensitivität durch unspezifische Primer-Bindung an humane DNA bei einer 16S rDNA PCR

Linke Abbildung: Dokumentation der Amplifikation. Die Pfeile markieren einen Shift im Ct-Wert, aufgrund der Anwesenheit humaner DNA (hDNA), in Richtung späterer Zyklen in einer PCR zum Nachweis von P. aeruginosa DNA als Zielsequenz.

Rechte Abbildung: Plot der Ct-Werte versus bakterielle DNA Menge in An- oder Abwesenheit humaner DNA (42ng).

SepsiTest™ entfernt humane DNA

SepsiTest™ entfernt die humane DNA während der Probenvorbereitung und erhöht so die Sensitivität und Spezifität der Pathogendetektion. Das Prinzip wird in Abbildung 3 dargestellt. Im ersten Schritt werden die humanen Zellen selektiv lysiert, gefolgt von der Degradation der freigewordenen humanen DNA. Evtl. vorhandene Bakterien und/oder Hefen werden anschließend konzentriert und lysiert. Im letzten Schritt wird die DNA dieser Pathogene isoliert.

Abb. 3 Grafik der Probenvorbereitung mit SepsiTest™

Rechte Abbildung: Abwesenheit von humaner DNA im Agarosegel unter Verwendung von SepsiTest™ im Vergleich mit einer Gesamt-DNA-Extraktion ( QiaAmp, Qiagen). US, nicht gespiktes Blut.

SepsiTest™ verhindert falsch positive Signale

Die Gefahr eines falsch positiven Ergebnisses in einer generellen 16S PCR erhöht sich dramatisch durch die Anwesenheit von Kontaminationen mit bakterieller DNA, verursacht durch die Einbringung von Bakterien während der Handhabung, aber vor allem auch durch Verunreinigungen der PCR Reagenzien und der Arbeitsmaterialien. An erster Stelle steht hierbei die Taq Polymerase als Kontaminationsquelle, aber auch Primer und dNTPs können kontaminiert sein. Diese Kontaminationen sind besonders problematisch, wenn sehr geringe Keimzahlen detektiert werden sollen und dafür hochsensitive PCR Assays verwendet werden.

 
Molzym hat eine Technologie entwickelt, mit der DNA Kontaminationen entfernt werden und somit falsch-positive Signale minimiert.

Mit SepsiTest™ ist eine zuverlässige und sensitive Detektion von Pathogenen in klinischen Proben möglich. Der im Test enthaltene, hochaktive Mastermix erlaubt eine Detektion auch von sehr geringen Keimtitern, wie z.B. 40 cfu pro ml Blut für S. aureus. SepsiTest™ kann mit verschiedenen PCR-Cyclern verwendet werden, wie z.B. Roche LightCycler, ABI StepOne and Biorad Opticon

Referenzen:

E. Navarro, J. Escribano, J.A. Fernández, J. Solera (2002). Comparison of three different PCR methods for detection of Brucella spp. in human blood samples. FEMS Immunol. Med. Microbiol. 34: 147-151.